Quanto viene fatto pcr per le infezioni latenti. Come viene eseguita l'analisi PCR: una descrizione della procedura. Se viene data una macchia, è necessario

La diagnosi di malattie infettive di vario tipo, sia virali che batteriche, è finalizzata all'identificazione precoce dei patogeni, il che consente di prescrivere un trattamento tempestivo e particolarmente efficace. Il metodo più moderno per rilevare le infezioni è la PCR, che sta per reazione a catena della polimerasi. Qual è l'essenza di questo metodo e qual è il suo scopo?

L'essenza della reazione della polimerasi

La struttura di qualsiasi virus e microrganismo contiene molecole di RNA o DNA. È caratteristico che questi composti siano unici per ciascuno e quindi, isolando gli acidi nucleici in un esame del sangue negli adulti o nei bambini, è possibile effettuare una diagnosi con assoluta precisione.

Sfortunatamente, la concentrazione di DNA, sia nei campioni di sangue che in altri materiali biologici, è piuttosto bassa, quindi non può essere determinata con i normali metodi diagnostici. Per far fronte a questo problema, una volta è stata inventata la reazione a catena della polimerasi.

Quindi, l'essenza di questa analisi risiede nell'elaborazione specifica del campione di sangue, a causa della quale aumenta la concentrazione di molecole di DNA in esso e l'instaurazione del loro tipo in futuro consente di identificare il tipo di agente patogeno, nonché da fare la diagnosi corretta.

Come viene eseguito un esame del sangue PCR?

Il metodo PCR viene eseguito solo in condizioni di laboratorio. Per eseguirlo vengono utilizzati enzimi speciali che aumentano più volte la struttura dell'RNA e del DNA del paziente. In questo caso, un tale numero dovrebbe essere formato per consentire lo studio visivo. Durante il sondaggio, viene eseguita una copia di tale sito, che soddisfa le condizioni richieste sotto tutti gli aspetti. Che cos'è un esame del sangue PCR per l'RNA è interessante per molti.

Il laboratorio dispone del database necessario, che indica l'esatta struttura dei vari agenti infettivi. L'uso del metodo PCR consente non solo di stabilire il tipo di patogeno, ma anche di calcolarne la proporzione quantitativa.

La diagnostica PCR comprende anche alcune novità, tra le quali spiccano:

Collegamento di vari frammenti di DNA;

Introduzione della mutazione;

Determinazione della paternità, ecc.

Quali malattie vengono rilevate dalla PCR?

Grazie alla PCR è possibile identificare quasi tutte le patologie batteriche e virali. Per la ricerca, non solo il sangue può essere utilizzato, ma anche altri materiali biologici, come strisci dell'uretra e della cervice uterina, saliva, sperma. L'analisi diventa abbastanza informativa quando l'agente eziologico di una certa malattia entra nel sangue umano. Ecco perché un esame del sangue per PCR è prescritto per le seguenti patologie:

Epatite virale di tipo A, B, C, D e TT;

Infezione di natura erpetica (cioè virus del primo, secondo e quarto tipo);

Citomegalovirus;

Infezione enterovirale;

infezione da HIV;

Rosolia;

Listeriosi;

Herpes zoster;

Mononucleosi infettiva;

Toxoplasmosi.

Se prendiamo in considerazione l'implementazione della PCR utilizzando altri biomateriali, è necessario aggiungere quanto segue all'elenco delle patologie che possono essere rilevate utilizzando questo metodo:

salmonellosi;

Difterite;

Gardnerellosi;

Micoplasmosi;

Tubercolosi;

tricomoniasi;

- infezione da papillomavirus (circa un centinaio di diversi ceppi del papillomavirus umano).

Di particolare rilevanza è ora diventato un esame del sangue PCR durante la gravidanza per le infezioni TORCH, che includono toxoplasmosi, citomegalovirus, infezione da herpes e rosolia. Ciò è dovuto al fatto che le suddette malattie possono causare anomalie nello sviluppo del feto.

Vantaggi della PCR

Quali sono i vantaggi di questo metodo?

• Precisione della diagnosi al cento per cento: se nel sangue sono presenti almeno diversi frammenti di DNA dell'agente patogeno, saranno determinati dalla reazione PCR, il che significa che verrà effettuata la diagnosi corretta. Questa è la principale differenza tra questo metodo e altri metodi diagnostici: un esame emocromocitometrico completo, ELISA e altri.
• Specificità. Durante l'analisi del sangue PCR per la borreliosi, ad esempio, non esiste un risultato falso negativo o falso positivo, che lo distingue dal test immunoenzimatico o ELISA.
• L'analisi può essere eseguita per determinare più patogeni contemporaneamente sulla base di un singolo campione di biomateriale, rendendo questo metodo conveniente per il paziente, poiché non deve eseguire l'analisi più volte.
• Rapidità. Non è necessario isolare e far crescere l'agente patogeno su speciali mezzi nutritivi, necessari durante l'esame batteriologico. È possibile ottenere il risultato finale il giorno dell'analisi.

• Per mezzo di un esame del sangue PCR per l'epatite, ad esempio, viene determinato un agente causale nascosto della malattia nel corpo quando il paziente agisce come portatore dell'infezione (HIV o epatite).
• Prezzo abbordabile. Il costo dell'analisi PCR per determinare un agente patogeno varia da duecentocinquanta a cinquecento rubli. Un esame semiquantitativo per i virus costa un po 'di più - circa mille rubli.

Svantaggi del metodo

La PCR è un metodo di ricerca high-tech che pone requisiti elevati alle apparecchiature di laboratorio. La stanza per le analisi deve necessariamente avere un filtro biologico, poiché nell'aria sono sempre presenti particelle di saliva e di pelle, che contengono molecole di DNA. Il mancato rispetto dei requisiti tecnici per lavorare con i biomateriali può portare a diagnosi errate.

Chi dovrebbe fare un esame del sangue per la PCR?

Chiunque può partecipare al sondaggio. L'indicazione è il sospetto di infezioni a trasmissione sessuale (infezione da HIV, vaginosi batterica, clamidia). Se si è verificato accidentalmente un contatto sessuale non protetto, solo la PCR consentirà di fare una diagnosi corretta in una fase precoce, se una persona è stata infettata da una particolare malattia.

Il sangue per il complesso TORCH è obbligatorio per le donne in gravidanza, così come per coloro che stanno solo pianificando di concepire un bambino.

Sebbene la PCR sia il massimo metodo efficace diagnostica, ma non è necessario andare in cicli al suo interno. È necessario esaminare il paziente in presenza di qualsiasi patologia in modo completo. Se la reazione a catena della polimerasi consente di determinare l'agente patogeno, grazie a uno studio sierologico è possibile valutare il livello di efficacia della terapia, la reazione del corpo umano all'agente patogeno e ai farmaci. Un esame del sangue PCR per l'HIV dovrebbe essere ordinato da un medico.

Caratteristiche della procedura e della preparazione

I pazienti che vengono esaminati utilizzando la tecnica PCR ricevono il risultato più affidabile. C'è da dire che in questo caso la probabilità di errore è quasi del tutto eliminata. Anche i risultati di questa analisi vengono preparati abbastanza rapidamente, il che rende più facile determinare la diagnosi e diventa possibile prescrivere tempestivamente le procedure mediche necessarie.

L'affidabilità del risultato ottenuto con il metodo PCR è determinata dalla corretta consegna del materiale biologico per l'esame. Non dovrebbe essere contaminato da nulla, altrimenti il ​​risultato non sarà obiettivo.

• il divieto di rapporti sessuali il giorno prima della procedura;
• un esame del sangue per rilevare le infezioni deve essere effettuato al mattino e solo a stomaco vuoto;
• l'urina viene somministrata anche al mattino in un contenitore sterile.

Uno e mezzo o due giorni dopo la procedura, l'analisi del sangue PCR verrà decodificata e il risultato è pronto. Ci sono anche casi in cui puoi ottenere il risultato lo stesso giorno.

Come preparare il materiale per l'analisi?

Per condurre lo studio nel modo più efficace possibile, è necessario prelevare correttamente il materiale dal paziente e condurre la sua preparazione competente. È risaputo che in uno studio di laboratorio si verifica un gran numero di errori (fino a circa il settanta per cento) durante la preparazione del campione.

Attualmente, in alcuni laboratori, il sangue viene prelevato utilizzando sistemi sottovuoto. Da un lato danneggiano minimamente il paziente, dall'altro consentono di prelevare il materiale in modo che non venga a contatto né con l'ambiente né con il personale. Ciò evita la contaminazione del materiale biologico e massimizza l'affidabilità dell'analisi.

Decifrare i risultati

Il risultato di un esame del sangue per la PCR può essere positivo o negativo. Se l'analisi del sangue è negativa, ciò indica l'assenza di agenti patogeni infettivi nel materiale consegnato dal paziente. Un'analisi positiva conferma la presenza di agenti infettivi nel sangue, il che significa che è necessario il trattamento più efficace e di alta qualità del paziente.

Il risultato ottenuto può essere positivo anche in assenza di qualsiasi sintomo della malattia. Ciò indica o l'inizio del processo patologico o che la persona è un portatore. Se quest'ultimo viene rilevato, non sono necessarie procedure mediche. In questo caso, si raccomanda al paziente di essere costantemente monitorato da un medico, il che implica, ad esempio, un esame del sangue PCR periodico per l'herpes e altre infezioni.

Molto spesso si trovano nell'uretra, nei raschiati realizzati dal canale cervicale, nella saliva. Tuttavia, va ricordato che un malato è in grado di infettare persone perfettamente sane, anche se non è infastidito da questa malattia. Può diventare cronico. C'è da dire che con un risultato positivo ottenuto mediante PCR, è necessario prescrivere adeguate procedure mediche.

Caratterizzazione quantitativa della PCR

Anche un esame del sangue PCR per le infezioni è caratterizzato quantitativamente. Un tale risultato può essere valutato solo da uno specialista, poiché è individuale per varie infezioni. È la caratteristica quantitativa che consente al medico di determinare il grado di attività di un tale processo patologico, di determinare lo stadio esatto di sviluppo di una particolare malattia.

Lo studio dei risultati ottenuti aiuterà lo specialista a scegliere il farmaco appropriato, a specificare il dosaggio richiesto.

Precisione diagnostica

Ci sono tre caratteristiche più importanti della PCR, vale a dire:

sensibilità;

Specificità;

Precisione.

La diagnosi di infezioni mediante PCR è caratterizzata da un'alta probabilità di rilevare agenti infettivi nel corpo. L'analisi del sangue e di altri fluidi è altamente specifica. Grazie a lui, puoi facilmente determinare uno specifico processo infettivo superando, ad esempio, un esame del sangue PCR per l'epatite o l'HIV. Inoltre, la diagnostica PCR è altamente sensibile. Se è presente un numero minimo di agenti infettivi nel materiale del test, il metodo PCR sarà sempre positivo.

In casi molto rari si può ottenere un risultato falso positivo. In assenza di infezione, sarà, di conseguenza, negativo.

Identificazione di malattie nascoste

Se una persona è sospettata di avere una IST, viene prescritto un esame del sangue per determinare le infezioni nascoste. Eventuali malattie dell'area genitale possono essere determinate solo esaminando il paziente.

Le seguenti malattie possono avere natura latente del corso:

• ureaplasmosi;
• clamidia;
• micoplasmosi;
• herpes;
• gonorrea;
• gardnerellosi.

Queste infezioni sono abbastanza comuni e molto insidiose. All'inizio della malattia, non hanno sintomi ben definiti, quindi i pazienti non vanno da uno specialista. I risultati di un tempestivo esame del sangue PCR per clamidia, borreliosi e altre infezioni aiuteranno il medico a prescrivere un trattamento efficace.

Le malattie sessualmente trasmissibili influiscono negativamente sul sistema riproduttivo. Possono causare infertilità o la comparsa di difetti nel feto. Ecco perché è importante fare un test PCR prima di pianificare una gravidanza.

Contenuto

Coloro che sono interessati a nuovi metodi diagnostici dovrebbero scoprire qual è il metodo PCR. Moderne capacità tecniche nel settore ricerca di laboratorio fornire l'opportunità di rilevare molte malattie nelle fasi iniziali. La reazione a catena della polimerasi (PCR) è attualmente considerata il metodo più accurato e nuovo.

Analisi PCR

Analisi PCR: che cos'è? Questo metodo utilizza i principi della biologia molecolare. Per studiare il materiale vengono utilizzati enzimi speciali che copiano ripetutamente e rapidamente il DNA, frammenti di RNA di agenti patogeni. Esiste tipi diversi Analisi PCR a seconda del materiale studiato (sangue, urina, feci, ecc.). Dopo l'elaborazione, il personale di laboratorio confronta il risultato con il database, identifica la concentrazione, il tipo di patogeno.

L'analisi PCR è posta in uno speciale amplificatore (dispositivo) che riscalda e raffredda le provette con il biomateriale. Le variazioni di temperatura sono necessarie per la replica dei frammenti. L'accuratezza del risultato dipenderà dall'accuratezza del regime di temperatura. Il metodo di reazione a catena della polimerasi aiuta a identificare:

• Mononucleosi infettiva;
• infezione da citomegalovirus;
• epatite virale G, C, B, A;
• infezioni/malattie sessualmente trasmissibili (IST/MST): gardnerellosi, tricomoniasi, ureaplasmosi;
• infezione erpetica;
• virus oncogeni;
• listeriosi;
• infezione da elicobatterio;
• encefalite da zecche, borreliosi;
• tubercolosi;
• candidosi.

Sangue

Al momento, a causa della novità della tecnologia, l'analisi del sangue PCR ha ancora un prezzo elevato. Per la preparazione del biomateriale non è necessario rispettare determinati requisiti. Anche causati dall'attività fisica, dallo stress, dal cambiamento nella dieta, i cambiamenti nella composizione non influiscono sul risultato dello studio. Un esame del sangue PCR può solo rovinare l'assunzione di agenti antibatterici, quindi, prima di assumerlo, è necessario fare una pausa tra il trattamento e il test.

L'analisi del sangue PCR è l'opzione più comune per diagnosticare patologie infettive croniche acute con una manifestazione virale o atipica. I metodi di ricerca sierologica hanno una certa difficoltà nell'esecuzione: la presenza di un agente patogeno è determinata dalla presenza di anticorpi nel corpo umano. Il risultato potrebbe essere falso negativo se le condizioni del paziente non dessero tempo al loro sviluppo.

sbavare

Nel campo della ginecologia, l'analisi dello striscio PCR viene utilizzata per studiare la presenza di microrganismi infettivi. Il lavoro con il materiale viene eseguito secondo lo stesso principio del sangue: un aumento multiplo dei frammenti di DNA dell'agente patogeno per identificarlo facilmente. Aiuta anche a rilevare le infezioni nascoste in una donna. Vari fluidi biologici possono essere prelevati per l'analisi: saliva, espettorato, urina, sangue. In ginecologia, per l'accuratezza della determinazione, viene più spesso utilizzato uno striscio dalla mucosa vaginale del canale cervicale.

Ci sono alcune indicazioni per la PCR. Spesso è necessario identificare un tipo di agente patogeno resistente agli antibiotici. Nelle donne, le principali indicazioni per la diagnosi con questo metodo sono:

• una gravidanza difficile;
• fase acuta delle malattie sessualmente trasmissibili;
• se c'è il sospetto del passaggio delle malattie sessualmente trasmissibili allo stadio cronico;
• ricerca delle cause dell'infertilità.

Cala

Per rilevare l'infezione, il medico può prescrivere un test PCR fecale. Per ottenere i risultati più affidabili dopo il test, è necessario rispettare le seguenti regole prima di prelevare il biomateriale:

• interrompere l'assunzione di lassativi per alcuni giorni: oli, supposte;
• escludere i medicinali che danno un colore specifico alle feci, ad esempio con contenuto di ferro.

Per il campionamento, utilizzare un bastoncino sterile e un contenitore. Qualcosa per pulirli in aggiunta, non è necessario risciacquare. Durante la raccolta del materiale, fare attenzione a non toccare le pareti interne del contenitore con le mani. Assicurati che non ci siano impurità di urina nelle feci, non puoi usare aiuti aggiuntivi per i movimenti intestinali (clisteri). È necessario ritirare il materiale il giorno della consegna, è sufficiente 1/3 del volume del contenitore. Questo metodo diagnostico presenta i seguenti vantaggi:

Urina

Se necessario, il medico può prelevare l'urina per il test. L'elevata precisione apre la possibilità di lavorare con qualsiasi fluido biologico da cui è possibile estrarre il DNA del virus. Per superare un test delle urine PCR, è necessario rispettare le seguenti restrizioni prima di prendere il materiale:

• almeno 1 giorno prima della procedura, interrompere i rapporti sessuali;
• 3 settimane prima della consegna, qualsiasi trattamento antibatterico dovrebbe essere completato, perché i medicinali offuscheranno l'immagine;
• è necessario eseguire il test a stomaco vuoto (sono vietati anche i liquidi);
• devi prendere la prima porzione mattutina del materiale.

Risultati del test PCR

Da quanto sopra, è chiaro cosa sia l'analisi PCR e sono visibili i chiari vantaggi di questo metodo di ricerca. Un altro vantaggio di questa procedura diagnostica è la facilità di decifrazione dei risultati. Considerando la quantità di analisi PCR eseguita (il processo stesso richiede circa 5 ore, ma il laboratorio rilascia i dati in 1-2 giorni), questo metodo diagnostico diventa l'opzione migliore per determinare molte infezioni. Sulla base dei risultati, il medico potrebbe dirti che il test:

1. Negativo: il materiale studiato non conteneva l'agente patogeno desiderato.
2. Positivo - Sono stati trovati RNA, DNA dell'agente patogeno.

A volte viene eseguita la determinazione quantitativa dei microrganismi. Ciò è necessario per le malattie che causano agenti patogeni opportunisti. La particolarità di questi virus è che appaiono solo in eccesso ed è estremamente problematico trovarli con gli studi convenzionali. Questo fattore è importante per la scelta delle tattiche terapeutiche al fine di trattare efficacemente le infezioni virali, ad esempio l'epatite, l'HIV.

Per 12 contagi

Per comprendere appieno cos'è la PCR per diagnosticare le infezioni e quanto sia efficace, è necessario sapere che è in grado di isolare fino a 12 agenti patogeni. Il testo viene eseguito solo in condizioni di laboratorio. Per la ricerca vengono utilizzati enzimi speciali, che aumentano di molte volte la quantità di RNA, frammenti di DNA del virus. L'analisi PCR per 12 infezioni può rivelare:

• micobatterio tubercolare;
• citomegalovirus;
• epatite C, G, B, A;
• herpes 1, 2 tipi;
• virus di Epstein-Barr (mononucleosi infettiva);
• infezioni trasmesse sessualmente, ad esempio, dalla clamidia;
• listeriosi;
• infezione da candida;
• helicobacter pylori;
• borreliosi, encefalite da zecche.

Per l'epatite C

Questo metodo diagnostico aiuta a determinare la presenza del virus nel sangue. Questo dà ai medici l'opportunità di parlare della sua presenza o assenza. Esistono due tipi di analisi PCR per l'epatite C: qualitativa e quantitativa. La prima opzione indica solo la sua presenza e può essere scritta "rilevato" / "non rilevato". Questo tipo di test ha una sensibilità di 10-500 UI/ml. Ciò suggerisce che con un basso contenuto dell'agente patogeno nel corpo, l'analisi "non verrà rilevata".

L'analisi quantitativa è più accurata e mostrerà la concentrazione di infezione nel sangue. Questo indicatore è designato come "carica virale", misurata nella quantità di RNA virale per volume specifico di sangue. La decrittazione in diversi laboratori può variare. Oltre alla misurazione in IU / ml, vengono utilizzate unità "copia". È possibile ricalcolare le copie per UI utilizzando la formula: 1 UI = 4 copie. Se nella trascrizione il valore della presenza del virus supera 800.000 UI/ml (o 800*103), questo indica un alto contenuto del patogeno.

Per la tubercolosi

Il test dovrebbe essere fatto al mattino. Questo è importante per evitare che tutto l'espettorato che si è formato durante la notte lasci lo stomaco. L'analisi PCR per la tubercolosi è importante quanto l'ELISA, Mantoux, la tomografia. Il test aiuta a identificare la presenza di micobatteri, lo stato delle urine, immunoglobuline totali, VES e determinare lo stato attuale dei polmoni. Per l'accuratezza dell'ottenimento dei risultati nell'analisi della PCR, è necessario eseguirla nel rispetto delle seguenti regole:

1. La semina viene eseguita 3 volte, ma l'aspirazione completa del contenuto dello stomaco deve essere eseguita solo in ospedale.
2. Rileva i micobatteri mediante coltura di masse esistenti nello stomaco in meno del 50% delle diagnosi. Anche quando si ottengono condizioni ottimali, si consiglia invece l'ecografia.
3. Anche con un risultato negativo, la probabilità di sviluppare la tubercolosi con un cambiamento nella VES, immunoglobuline o altri indicatori non può essere completamente esclusa.
4. La coltura PCR è meno suscettibile alle condizioni patologiche se ottenuta come parte di un esame broncoscopico, che esclude il sospetto di tubercolosi in un bambino.

Per l'HIV

Per molte persone, questa diagnosi è considerata una condanna a morte. Per questo motivo, dopo i frequenti rapporti sessuali, una persona diventa più attenta ai segnali che il suo corpo dà (e talvolta li emette). L'opzione più affidabile per ottenere la conferma o la confutazione di questa malattia è un test PCR per l'HIV. Il test può essere utilizzato per identificare i seguenti possibili problemi di salute:

1. Negazione/conferma della presenza di HIV durante il periodo del cavallo sieronegativo.
2. Determinazione del genotipo di HIV-1, HIV-2.
3. Chiarimento della descrizione del processo patologico con un risultato dubbio dell'immunoblot.
4. Infezione dopo trasfusione di sangue.
5. Determinazione dello stato di HIV nei bambini nati da madri portatrici.
6. Aiuta a stabilire il monitoraggio della carica virale del corpo.

Per HPV

Il virus del papilloma può essere rilevato in qualsiasi persona, per molto tempo può essere in uno stato latente. Lo sviluppo provoca un indebolimento del sistema immunitario, stress o esplosioni emotive. L'analisi PCR per HPV aiuta a determinare la concentrazione del virus nel sangue. Per questo motivo si raccomanda di effettuare una determinazione quantitativa piuttosto che qualitativa. Questi dati aiuteranno a prevedere la probabilità di sviluppare una natura maligna dell'infezione.

La tecnica per diagnosticare la presenza di HPV si basa sulla proprietà principale della PCR di isolare il DNA del virus dal materiale. A causa dell'elevata sensibilità del test, verrà rilevata anche una piccola quantità di batteri. La ricerca quantitativa offre ai medici l'opportunità di determinare il grado di pericolo della malattia, di fare una prognosi per il futuro. Questa diagnosi è obbligatoria per tutti gli uomini e le donne che si sono trovati con le verruche. L'analisi quantitativa della PCR aiuterà a determinare cosa ha causato lo sviluppo dell'HPV: una temporanea diminuzione dell'immunità o una malattia cronica.

Per l'herpes

Questo tipo di diagnostica in microbiologia aiuta a eseguire l'analisi PCR per l'herpes con elevata precisione. La copia dei frammenti di DNA del virus avverrà solo se il gene desiderato è presente nel materiale. In questo caso, il test basato sui risultati della condotta può indicare la presenza o l'assenza dell'agente patogeno. Sarà possibile rilevarlo anche a bassa concentrazione nel sangue.

Un altro vantaggio dell'analisi PCR è che può rilevare un'infezione da virus dell'herpes immediatamente dopo l'infezione, prima dell'inizio dei sintomi clinici. È possibile determinare il tipo di herpes (1 o 2), non è richiesta alcuna preparazione specifica per superare l'analisi, ma i medici raccomandano di rifiutare prima di prelevare il sangue:

• fritto;
• acuto;
• alcol;
• Grasso.

Durante la gravidanza

Quando si trasporta un bambino, è molto importante condurre questo studio per tenere conto delle condizioni della donna. L'analisi PCR durante la gravidanza è inclusa nell'elenco dei metodi più efficaci per determinare la presenza di una varietà di malattie. È necessario condurre un test non solo per identificare patologie, ma anche per determinare la probabilità di infezione del bambino nell'utero. Solo grazie alla diagnostica PCR è stato possibile identificare il grado di progressione, lo sviluppo di molte infezioni all'interno dell'utero materno.

Consegna delle analisi PCR

Se ti stai chiedendo come viene presa l'analisi PCR, allora dovrebbe essere considerato ogni singolo caso, tenendo conto del tipo di biomateriale. Ad esempio, raschiare, striscio o prelievo di sangue ha le sue caratteristiche.

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è un metodo di alta precisione nel campo della diagnosi di patologie ereditarie, infezioni, malattie virali in qualsiasi fase (acuta o cronica), nonché - in una fase precoce - prima delle manifestazioni evidenti della malattia identificando patogeni in base al loro DNA, RNA, che sono materiale genetico, in campioni ottenuti dal paziente. E oggi parleremo dell'essenza, delle fasi diagnostiche e dei principi dei metodi di reazione a catena della polimerasi (PCR), nonché del suo costo.

Cos'è la reazione a catena della polimerasi

La base dell'analisi è l'amplificazione (raddoppio) - la creazione di molte copie da una breve sezione del DNA (acido desossiribonucleico), che rappresenta il complesso genetico umano. Lo studio richiede una piccolissima quantità di sostanze fisiologiche (espettorato, feci, raschiamento dell'epitelio, succo prostatico, sangue, sperma, liquido amniotico, muco, tessuto placentare, urina, saliva, liquido pleurico, liquido cerebrospinale). In questo caso, ad esempio, anche un solo microbo dannoso può essere rilevato nel tratto urogenitale di un paziente.

La tecnica PCR (reazione a catena della polimerasi) è stata sviluppata dallo scienziato americano K. Mullis, che ha ricevuto il Premio Nobel nel 1993.

Utilizzato attivamente:

• nella diagnosi precoce delle infezioni, genetiche;
• nella visita medica forense in presenza di una piccolissima quantità di DNA per la ricerca;
• in veterinaria, farmaceutica, biologia, genetica molecolare;
• per l'identificazione di una persona mediante DNA, conferma della paternità;
• in paleontologia, antropologia, ecologia (nel monitoraggio della qualità dei prodotti, dei fattori ambientali).

Questo video ti dirà cos'è una reazione a catena della polimerasi:

A chi è assegnato

La reazione a catena della polimerasi nella diagnosi delle malattie infettive è uno dei metodi più affidabili di elevata precisione e affidabilità. Ad esempio, l'affidabilità dell'analisi PCR per la clamidia e molti altri agenti patogeni si avvicina al 100% (assoluto). Molto spesso, la procedura di reazione a catena della polimerasi viene prescritta a pazienti che, durante la diagnosi, hanno difficoltà a identificare un patogeno specifico.

Il test PCR di laboratorio viene utilizzato:

• rilevare gli agenti patogeni che causano infezioni degli organi urinari e genitali, che sono difficili da identificare utilizzando colture o metodi immunologici;
• per la ri-diagnosi dell'HIV nella fase iniziale in caso di risultato positivo, ma discutibile dell'analisi iniziale (ad esempio, nei neonati di genitori affetti da AIDS);
• stabilire una malattia oncologica in una fase precoce (studio delle mutazioni oncogene) e correzione individuale del regime di trattamento per un particolare paziente;
• ai fini della diagnosi precoce e del potenziale trattamento di patologie ereditarie.

Quindi, i futuri genitori vengono testati per scoprire se sono portatori di una patologia genetica; nei bambini, la PCR determina la probabilità di esposizione a una malattia ereditaria.

• per rilevare anomalie fetali termine iniziale gestazione (le singole cellule di un embrione in crescita vengono esaminate per possibili mutazioni);
• nei pazienti prima del trapianto d'organo - per la "tipizzazione dei tessuti" (che determina la compatibilità dei tessuti);
• rilevare pericolosi organismi patogeni nel sangue donato;
• nei neonati - per rilevare infezioni latenti;
• per valutare i risultati del trattamento antivirale e antimicrobico.

Perché seguire questa procedura?

Poiché la PCR è un metodo diagnostico altamente efficace che fornisce un risultato quasi del 100%, la procedura viene utilizzata:

• confermare o escludere la diagnosi finale;
• valutazione rapida dell'efficacia della terapia.

In molti casi, la PCR è l'unico test possibile per rilevare una malattia in via di sviluppo se altri metodi diagnostici batteriologici, immunologici e virologici sono inutili.

• I virus vengono rilevati dalla PCR immediatamente dopo l'infezione e prima della comparsa dei segni di malattia. La diagnosi precoce del virus consente un trattamento tempestivo.
• Anche la cosiddetta "carica virale" (o il numero di virus nell'organismo) è determinata dall'analisi quantitativa del DNA.
• Agenti patogeni specifici (come il bacillo tubercolare di Koch) sono difficili e richiedono troppo tempo per la coltura. L'analisi PCR consente di identificare rapidamente il numero minimo di agenti patogeni (vivi e morti) nei campioni che sono convenienti per la ricerca.

Viene utilizzata un'analisi dettagliata del DNA del patogeno:

• per determinarne la sensibilità a tipi specifici di antibiotici, che consentono di iniziare immediatamente il trattamento;
• controllare la diffusione delle epidemie tra gli animali domestici e selvatici;
• identificare e monitorare nuove specie microbiche contagiose e sottotipi di patogeni che hanno alimentato precedenti epidemie.

Tipi di diagnostica

Metodo standard

L'analisi della reazione a catena della polimerasi viene eseguita sulla base dell'amplificazione multipla (raddoppio) di uno specifico frammento di DNA e RNA utilizzando speciali enzimi primer. Come risultato della catena di copiatura, si ottiene una quantità di materiale sufficiente per la ricerca.

Durante la procedura viene copiato solo il frammento desiderato (corrispondente alle condizioni specifiche specificate) anche se effettivamente presente nel campione.

Questo video dettagliato con utili diagrammi racconta come funziona la PCR:

Altri metodi

• PCR in tempo reale. In questo tipo di studio, il processo di identificazione di un dato frammento di DNA inizia dopo ogni ciclo e non dopo che l'intera catena di 30-40 cicli è stata completata. Questo tipo di studio consente di ottenere informazioni sulla quantità di un agente patogeno (virus o microbo) nel corpo, ovvero di effettuare un'analisi quantitativa.
• RT-PCR (modalità di trascrizione inversa). Questo test viene utilizzato per trovare RNA a filamento singolo per rilevare virus la cui base genetica è l'RNA (ad esempio, virus dell'epatite C, virus dell'immunodeficienza). In tale studio viene utilizzato un enzima speciale: la trascrittasi inversa e un determinato primer e il DNA a filamento singolo è costruito sulla base dell'RNA. Quindi un secondo filamento di DNA viene ripristinato da questo filamento e viene eseguita la procedura standard.

Indicazioni per la tenuta

La procedura PCR è utilizzata nella clinica delle malattie infettive, neonatologia, ostetricia, pediatria, urologia, ginecologia, venereologia, neurologia, nefrologia, oftalmologia.

Indicazioni ai fini dell'analisi:

• chiarimento del rischio di sviluppare anomalie genetiche in un bambino con probabilità di patologie ereditarie;
• diagnosticare entrambi i genitori quando si pianifica una gravidanza o una grave condizione della madre durante una gravidanza in corso;
• difficoltà con il concepimento, identificazione delle cause dell'infertilità;
• sospetto di infezioni sessuali nella fase acuta e con sintomi del loro passaggio a cronico;
• rilevamento delle cause dei processi infiammatori di origine poco chiara;
• contatti sessuali casuali e costanti non protetti;
• determinazione della sensibilità di un microrganismo patogeno ad antibiotici specifici;
• pazienti con sospetta infezione latente per rilevare i patogeni prima dello sviluppo di sintomi conclamati (diagnosi preclinica);
• pazienti per confermare la guarigione dopo la malattia (diagnosi retrospettiva);

La diagnostica viene utilizzata anche se è necessario identificare con precisione i seguenti agenti patogeni:

• virus dell'epatite (ABC G), immunodeficienza umana, citomegalovirus;
• vibrione del colera;
• virus dell'herpes simplex, specie erpetiforme;
• retro - adeno - e rhinovirus;
• virus della rosolia, Epstein-Barr, varicella (Zoster - virus);
• parvo e picornavirus;
• batterio Helicobacter pylori;
• legionella, tipi patogeni di Escherichia coli;
• Staphylococcus aureus;
• agente patogeno;
• Clostridi, difterite e Haemophilus influenzae;

Viene anche utilizzato per determinare le infezioni:

• Mononucleosi infettiva;
• borreliosi, listeriosi, encefalite da zecche;
• candidosi causata da funghi Candida;
• infezioni sessuali - tricomoniasi, ureaplasmosi, treponema pallido, gardnerellosi, gonorrea, micoplasmosi, clamidia;
• tubercolosi.

Controindicazioni per la detenzione

Poiché la procedura non viene eseguita con il paziente, senza alcun effetto sull'organismo, ma con materiale biologico prelevato per la ricerca, non ci sono controindicazioni alla PCR per l'assenza di potenziale pericolo.

Tuttavia, il campionamento del biomateriale dal canale cervicale dell'utero non viene eseguito dopo la procedura di colposcopia. La consegna di strisci, raschiamenti per l'analisi è consentita solo da 4 a 6 giorni dopo la fine delle mestruazioni e la completa cessazione della dimissione.

Il metodo è sicuro?

Non è possibile alcun impatto negativo sul paziente in uno studio isolato del suo biomateriale in laboratorio.

Preparazione per la procedura (consegna di sostanze biologiche per analisi)

Come campione per l'analisi PCR, in cui viene rilevato il DNA di un agente patogeno estraneo, viene utilizzato qualsiasi fluido biologico, tessuto, secrezioni corporee. Il campionamento della sostanza in esame viene effettuato sotto forma di prelievo di sangue da una vena, raschiatura dalla laringe, dalla cavità nasale, dall'uretra, dalla cavità pleurica, dalla cervice.

Prima della procedura diagnostica, il medico spiega al paziente quale materiale verrà prelevato:

1. Quando si esaminano le infezioni sessuali, vengono prelevate le secrezioni dagli organi genitali, l'urina e una macchia dall'uretra.
2. Quando si analizzano infezioni da herpes, citomegalovirus, mononucleosi - prelevano l'urina, un tampone faringeo per l'analisi, per epatite, toxoplasmosi - sangue da una vena.
3. Per diagnosticare vari tipi, viene prelevato il liquido cerebrospinale.
4. In pneumologia, i campioni per l'analisi sono l'espettorato e il liquido pleurico.
5. Quando si conduce uno studio su possibili infezioni intrauterine durante la gestazione, per l'analisi vengono utilizzati il ​​liquido amniotico e le cellule placentari.

L'affidabilità e l'accuratezza dell'analisi dipendono dalla sterilità delle condizioni durante il prelievo del materiale. Poiché il test PCR è altamente sensibile, qualsiasi contaminazione della sostanza in esame può falsare il risultato.

Una preparazione competente per la consegna del biomateriale non presenta alcuna difficoltà per i pazienti. Ci sono alcune raccomandazioni:

• quando si analizzano le infezioni sessuali:
  • escludere contatti intimi 72 ore prima della consegna del materiale;
  • smettere di usare prodotti vaginali per 3 giorni;
  • dalla sera del giorno precedente, non effettuare l'igiene dell'area oggetto di studio;
  • escludere la minzione per 3-4 ore quando si preleva un campione dall'uretra;
• interrompere l'assunzione di antibiotici un mese prima del test per le infezioni;
• donare il sangue al mattino prima di mangiare e bere;
• la raccolta della prima porzione mattutina di urina viene effettuata in un contenitore sterile dopo un'accurata toilette intima.

Ulteriori informazioni su come viene eseguita la diagnostica utilizzando il metodo di reazione a catena della polimerasi.

Com'è la procedura

Quando si esegue uno studio PCR più e più volte nel reattore (amplificatore o termociclatore), vengono ripetuti alcuni cicli:

1. Il primo passo è la denaturazione. La saliva, il sangue, la biopsia, i campioni ginecologici, l'espettorato, in cui si sospetta la presenza del DNA (o RNA) dell'agente patogeno, vengono posti in un amplificatore, dove il materiale viene riscaldato e il DNA viene diviso in due catene separate.
2. La seconda fase è la ricottura o un leggero raffreddamento del materiale. e aggiungendo ad esso primer in grado di riconoscere le sezioni desiderate nella molecola di DNA e legarsi ad esse.
3. Il terzo passo è l'allungamento- si verifica dopo l'aggiunta di 2 primer a ciascuno dei filamenti di DNA. Durante il processo, il frammento di DNA dell'agente patogeno viene completato e viene formata la sua copia.

Questi cicli si ripetono come una "reazione a catena", portando ogni volta al raddoppio delle copie di uno specifico frammento di DNA (ad esempio, un segmento in cui è programmato un determinato virus). In poche ore si formano molte copie del frammento di DNA e viene rilevata la loro presenza nel campione. Successivamente, i risultati vengono analizzati e confrontati con il database di vari tipi di agenti patogeni per determinare il tipo di infezione.

Leggi l'interpretazione dei risultati e la conclusione basata sulla reazione PCR di seguito.

Decifrare i risultati

Il risultato finale dello studio viene rilasciato 1-2 giorni dopo la consegna del materiale biologico. Spesso - già nel primo giorno dopo l'analisi.

Analisi qualitativa

• Negativo il risultato significa che non sono state trovate tracce di agenti infettivi nella sostanza sottoposta alla ricerca.
• Positivo per risultato si intende la rilevazione di virus o batteri patogeni in un campione biologico con un grado di accuratezza molto elevato al momento della presentazione.

Se il risultato è positivo, ma non ci sono segni di attivazione dell'infezione, questo stato del corpo è chiamato "trasporto sano" asintomatico. Più spesso osservato quando si preleva biomateriale da un determinato luogo (canale cervicale, uretra, cavità orale) nelle malattie virali. Il trattamento in questo caso non è richiesto, ma è necessaria una supervisione medica costante, poiché esiste la possibilità:

• diffusione del virus da portatori e infezione di persone sane;
• attivazione del processo e transizione della malattia a una forma cronica.

Tuttavia, se l'esame del sangue è positivo, questo indica che l'infezione ha colpito l'organismo, e questo non è più uno stato di portatore, ma una patologia che richiede una terapia specifica immediata.

Analisi quantitativa

Il risultato quantitativo è determinato dallo specialista specificamente per un particolare tipo di infezione. Sulla sua base, è possibile valutare il grado di sviluppo, lo stadio della malattia, che consente di prescrivere tempestivamente il trattamento corretto.

costo medio

I prezzi per condurre una reazione a catena della polimerasi sono determinati da: il tipo di studio, la complessità di identificazione del patogeno, la difficoltà di raccogliere materiale biologico, il tipo di analisi (qualitativa o quantitativa), il livello dei prezzi in laboratorio.

D'altra parte, nello studio della PCR, è possibile rilevare più agenti patogeni contemporaneamente quando si preleva un tipo di materiale per l'analisi. Ciò consente di risparmiare su altri test di laboratorio.

Approssimativamente, il costo dell'analisi PCR in rubli:

• gonococcus, gardnerella, trichomonas vaginalis - dal 180
• clamidia trachomatis - dal 190
• papillomavirus - da 380 a 500
• biocenosi del tratto urogenitale nelle donne (valutazione quantitativa e qualitativa della microflora) - dall'800.

Ancora di più informazioni utili per quanto riguarda lo studio PCR, vedere il video qui sotto:

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è un metodo di diagnostica genetica molecolare ad alta precisione, che consente di rilevare varie malattie infettive ed ereditarie nell'uomo, sia nelle fasi acute che croniche, e molto prima che la malattia possa manifestarsi.

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è stata sviluppata nel 1983 da Cary Mullis (USA), per la quale è stato insignito del Premio Nobel per la Chimica nel 1993.

L'analisi PCR è diventata una sorta di "gold standard" per la maggior parte delle infezioni. La maggior parte degli specialisti lo affronta quasi ogni giorno e non può immaginare di fare una diagnosi finale senza di essa. La PCR diventa spesso l'unica reazione per rilevare gli stadi attivi della malattia nei momenti in cui altri metodi diagnostici batteriologici, virologici e immunologici non funzionano.

Vantaggi della diagnostica PCR nella medicina moderna:

Rilevamento diretto della presenza di un patogeno (vale a dire, una regione specifica del DNA o RNA del patogeno) nel campione di prova.
L'elevata specificità consente di determinare una sezione unica di DNA o RNA caratteristica di un particolare patogeno, eliminando la possibilità di false reazioni.
L'elevata sensibilità del metodo PCR permette di rilevare anche singole cellule di agenti patogeni (virus, batteri). La sensibilità dell'analisi PCR è di 10-1000 cellule nel campione di prova (ad esempio, la sensibilità dei test immunologici e microscopici è di sole 103-105 cellule).
Sviluppo di una tecnica PCR universale per il rilevamento di vari agenti patogeni. L'oggetto della ricerca mediante PCR è il materiale genetico (DNA, RNA) del patogeno. La tecnica consente di rilevare diversi agenti patogeni da un campione biologico.
Risultati dell'analisi relativamente veloci. Uno studio completo viene eseguito in 4-4,5 ore, meno spesso - un po' più a lungo.
La capacità di rilevare gli agenti patogeni prima dell'insorgenza dei sintomi della malattia (diagnosi preclinica) e dopo la malattia pregressa (diagnosi retrospettiva). Un esempio di diagnosi preclinica potrebbe essere un esame durante il periodo di incubazione (dal momento dell'infezione all'inizio dei reclami del paziente), nonché un'infezione latente (quando non ci sono sintomi, ma ci sono solo dati di laboratorio - PCR , Per esempio). Uno dei punti importanti della diagnostica PCR è la PCR nel materiale d'archivio o nei resti biologici, che è importante per identificare una persona o una paternità.

Attualmente, la diagnostica PCR è in fase di sviluppo significativo. Il metodo stesso viene migliorato, nuovi tipi di PCR compaiono ancora e ancora, nuovi sistemi di test per questa reazione entrano nel mercato medico. Per questo motivo, il costo degli studi PCR sta diventando ogni anno più accessibile per un'ampia gamma di pazienti.

Qual è la base del metodo PCR

La base della reazione a catena della polimerasi è il raddoppio ripetuto (amplificazione) di una determinata sezione di DNA o RNA utilizzando enzimi in laboratorio. Di conseguenza, si forma la quantità di DNA o RNA sufficiente per l'analisi visiva. Durante lo studio viene copiata solo l'area che si adatta alle condizioni specificate e solo nella situazione della sua presenza nel campione di prova.

Ad esempio, un materiale per la ricerca, in cui è prevista la presenza di frammenti di DNA o RNA dell'agente patogeno (saliva, sangue, urina, secrezioni degli organi genitali), è posto in un apposito reattore (amplificatore). Inoltre, vengono aggiunti enzimi specifici, che si legano al DNA o all'RNA dell'agente patogeno e ne viene sintetizzata una copia. Questa copia avviene in più fasi, come una "reazione a catena", e in definitiva da una copia materiale genetico si possono formare centinaia e migliaia di copie. Poi viene l'analisi e il confronto del risultato con il database esistente sulla struttura dei vari agenti patogeni. Attraverso la PCR, è possibile non solo identificare il tipo di agente patogeno, ma anche fornire un risultato quantitativo dell'analisi, ovvero quanti agenti patogeni ci sono nel corpo umano.

Il metodo PCR sta attualmente ampliando la gamma di possibilità per la ricerca in corso: l'introduzione di mutazioni, lo splicing di frammenti di DNA, ed è ampiamente utilizzato in medicina, ad esempio, per stabilire la paternità, l'emergere di nuovi geni e così via.

Quali infezioni possono essere rilevate utilizzando la diagnostica PCR

1) Infezione da HIV (è possibile rilevare il virus dell'immunodeficienza umana HIV-1)
2) Epatite virale A, B, C, G (RNA-HAV, DNA-HBV, RNA-HCV, RNA-HGV)
3) Mononucleosi infettiva (DNA del virus di Epstein-Barr - EBV)
4) Infezione da citomegalovirus (DNA-CMV)
5) Infezione erpetica (DNA - virus herpes simplex tipi HSV 1 e 2)
6) IST (infezioni sessualmente trasmissibili) - ureaplasmosi, gardnerellosi, clamidia, micoplasmosi, tricomoniasi,
7) Tubercolosi (micobatterio tubercolare)
8) Virus oncogenici - infezione da papillomavirus (papillomavirus umano (comprese le sue specie oncogeniche 16, 18, 31, 33, 45, 51, 52, 56, 58 e 59)
9) Borreliosi, encefalite da zecche
10) Listeriosi
11) Candidosi (funghi del genere Candida)
12) Infezione da Helicobacter pylori
e altri

Considerando lo spettro dei patogeni, la diagnostica PCR è attivamente utilizzata nella pratica ginecologica, urologica, delle malattie infettive, pneumologia, fisiologia, gastroenterologia, ematologia, oncologia e altri.

Materiale per la ricerca e regole per la sua raccolta

Il materiale per la ricerca PCR, in cui è possibile rilevare il DNA estraneo di un batterio o il DNA o l'RNA di un virus, può essere vari mezzi biologici e fluidi umani: muco, urina, sangue, espettorato, raschiamento di cellule epiteliali, tessuti placentari, sangue , succo prostatico, liquido amniotico, liquido pleurico.

Durante lo screening per le infezioni a trasmissione sessuale (IST), uomini e donne prelevano le secrezioni dagli organi genitali, uno striscio o raschiamento dalla cervice, un tampone o raschiamento dall'uretra (uretra), urina.

Quando si esaminano le infezioni (infezioni erpetiche, CMVI, mononucleosi, toxoplasmosi, epatite B, C, infezione da HIV), il sangue viene prelevato per la PCR.

Per la diagnosi di mononucleosi infettiva, CMVI, infezione erpetica, viene prelevato un tampone dalla gola, per l'esame di CMVI - urina. Spesso, in numerosi studi, il liquido cerebrospinale viene esaminato per verificare la presenza di danni al sistema nervoso.

In pneumologia, il materiale è l'espettorato, il liquido pleurico.

Quando si esaminano le infezioni intrauterine - liquido amniotico, tessuto placentare.

Preparazione per la consegna del materiale e diagnostica PCR

Quasi tutti i pazienti sottoposti a diagnostica PCR hanno il diritto di contare su un risultato affidabile, accurato e veloce, che dipende in larga misura dalle capacità del laboratorio e dalla professionalità dell'assistente di laboratorio. Allo stesso tempo, molti non pensano che questa stessa affidabilità dipenda in gran parte da noi stessi, in particolare dalle raccomandazioni del medico curante, dallo stile di vita e dalla correttezza del campionamento materiale. Quando si campiona il materiale, sono richieste condizioni che escludano la contaminazione (contaminazione) del materiale e, di conseguenza, mettano in dubbio l'obiettività dell'analisi.

Una corretta preparazione per la consegna del materiale non è particolarmente difficile. Ci sono le seguenti raccomandazioni dei medici per i pazienti:

1) non vivere sessualmente un giorno prima della consegna del materiale;
2) il sangue per la ricerca viene somministrato al mattino a stomaco vuoto (non mangiare, non bere);
3) durante la minzione, la prima porzione mattutina viene raccolta in un contenitore pulito e sterile.

Scadenze per l'analisi PCR

Il risultato finale è pronto in 1,5-2 giorni dopo la consegna del materiale. In alcuni casi, il risultato è pronto il primo giorno.

Interpretazione dei risultati della PCR

Negativo il risultato della PCR indica che non sono state trovate tracce di agenti infettivi nel materiale di prova al momento della sua consegna. La maggior parte dei casi mostra l'assenza dell'infezione che è stata tentata di essere trovata nel campione del test.

Positivo il risultato della PCR indica la rilevazione di tracce di infezione nel campione biologico in studio. Con grande precisione, un risultato positivo indica la presenza di infezione in un dato momento.

Ci sono situazioni in cui la PCR è positiva, ma è impossibile parlare di un'infezione attiva: questa è la cosiddetta "carrozza sana" senza sintomi clinici della malattia, che non richiede trattamento, ma richiede l'osservazione dinamica da parte di un medico. Si osserva più spesso in una serie di infezioni virali (HPV, CMVI, infezione da EBV, infezione da herpes e altre) in materiali come la saliva, il raschiamento del canale cervicale, l'uretra, cioè da un focus locale. Tuttavia, non dobbiamo dimenticare che è possibile la trasmissione dell'infezione dai portatori a persone sane, così come il passaggio alla forma cronica della malattia con l'attivazione del processo. Se la PCR è positiva nel sangue, questo non è più uno stato di portatore e richiede un trattamento specifico.

Il risultato quantitativo della PCR viene valutato solo da un medico individualmente per una particolare infezione separatamente e non ha gradazioni generali. Sulla base del risultato quantitativo della PCR, il medico può determinare il grado di attività dell'infezione e impostare lo stadio della malattia, che influenzerà sicuramente il decorso e le dosi dei farmaci prescritti.

Una delle ultime interessanti domande: quanto è accurata la diagnostica PCR?

Esistono 3 definizioni per l'analisi PCR:

1. Precisione (con un alto grado di probabilità, è possibile il rilevamento o l'assenza di infezione).
2. Specificità (accuratezza nel rilevare un'infezione specifica).
3. Sensibilità (anche con un basso contenuto di materiale genetico di agenti patogeni nel campione di prova, l'infezione verrà rilevata).

La reazione a catena della polimerasi praticamente non produce risultati falsi positivi (cioè non ci sono campioni positivi dove non c'è infezione). I risultati falsi negativi sono rari (più spesso ciò è dovuto all'assenza di un'infezione attiva in una persona al momento). Ad esempio, infezione latente, infezione cronica fuori attività.

Specialista in malattie infettive Bykova N.I.

Video sul perché e come eseguire un test PCR per le infezioni

L'essenza del metodo diagnostico PCR

Il metodo della reazione a catena della polimerasi (PCR) si basa sui principi della biologia molecolare e appartiene al campo della ricerca genetica.

Qualsiasi organismo vivente contiene nella sua struttura molecole di acidi nucleici: DNA e RNA. Questa è una specie di passaporto genetico, che aiuta a determinare a quale specie appartiene questo o quel "portatore". Tuttavia, per scansionare questo "passaporto", fino a poco tempo fa, era necessaria una certa quantità minima di materiale biologico. Se la concentrazione di DNA era inferiore al necessario, l'analisi diagnostica non era possibile.

Durante la diagnosi mediante PCR, un campione di materiale biologico viene trattato con enzimi speciali (polimerasi), che consentono di avviare il processo di copia multipla del DNA (RNA) esistente. Utilizzando una cascata di reazione a catena, secondo il principio della progressione geometrica, in poche ore si possono ottenere diverse decine di trilioni di copie da una molecola di acido nucleico. Questo volume è più che sufficiente per qualsiasi studio comparativo.

Per l'analisi viene utilizzato un amplificatore in cui, in condizioni di temperatura rigorose, avviene il processo di replicazione multipla del DNA. Di solito sono sufficienti 20-30 cicli di replicazione. Ciascuno di essi comprende 3 fasi consecutive:

• denaturazione - riscaldamento della matrice del DNA a 96°C con distruzione dei legami idrogeno tra catene adiacenti;
• ricottura - abbassando la temperatura di 4°C per creare una forcella di replicazione;
• allungamento - il lancio di DNA polimerasi per la sintesi di nuove catene nucleotidiche basate sul genitore.

Ogni ciclo in tre fasi dura in media 15-20 minuti.

Vantaggi della diagnostica PCR

L'analisi PCR è high-tech e richiede professionalità da parte del personale di laboratorio, ma per la medicina moderna è diventata una fonte di opportunità senza precedenti nel campo della diagnostica accurata.

Vantaggi della PCR:

• universalità (può essere esaminato qualsiasi materiale biologico - dai globuli, saliva e capelli a punti sospetti sulla scena del crimine);
• alta soglia di sensibilità (il metodo è in grado di dare un risultato in presenza di singole cellule o singole molecole di DNA nel campione);
• multitasking: in un approccio è possibile rilevare contemporaneamente diversi tipi di vettori di informazioni (i metodi batteriologici non sono in grado di farlo, poiché richiedono mezzi nutritivi diversi per ciascun tipo di microrganismo);
• la capacità di condurre analisi quantitative accurate;
• velocità di elaborazione (a differenza di altri tipi di studi genetici, la diagnostica PCR richiede solo 5-7 ore);
• accuratezza del risultato (se si osserva la tecnologia, l'errore è praticamente escluso);
• costo relativamente basso (l'analisi PCR non va oltre il prezzo medio dei test standard).

Tutti questi vantaggi consentono di utilizzare la reazione a catena della polimerasi per il monitoraggio regolare del processo di trattamento.

Lo sviluppatore del metodo diagnostico PCR ha ricevuto il Premio Nobel per la sua "creazione" per un motivo. Il metodo di reazione a catena della polimerasi consente:

• determinare il ceppo di un agente infettivo con un contenuto minimo nel biomateriale (fino a singole strutture virali);
• calcolare l'esatta concentrazione dell'agente patogeno in tutto il corpo (per determinare la dose ottimale di farmaci);
• valutare il grado di effetti patologici sul paziente e identificare ceppi con elevata resistenza farmacologica;
• stabilire fasi successive dell'infezione e fare un'ulteriore prognosi.

È interessante! Le possibilità dell'analisi PCR sono molto più ampie della valutazione quantitativa e qualitativa del background infettivo nel corpo umano. Oltre a rilevare le infezioni, viene utilizzato per stabilire la parentela, determinare la personalità, identificare patologie genetiche e confrontare il biomateriale nella scienza forense.

Quali infezioni possono essere rilevate dalla diagnostica PCR

L'analisi PCR è in grado di calcolare con elevata precisione qualsiasi portatore infettivo incluso nel moderno catalogo medico delle malattie:

• agenti causali di epatite di tutti i tipi (la PCR consente di identificare la fonte dell'infezione nella fase del periodo di incubazione e iniziare il trattamento molto prima dell'insorgenza dei sintomi della malattia);
• patogeni di HIV e malattie sessualmente trasmissibili (ureaplasmi, micoplasmi, clamidia, trichomonas);
• un gruppo di infezioni TORCH (rilevanti quando si esaminano donne in gravidanza per la diagnosi precoce di patologie fetali);
• tubercolosi (forma latente della malattia);
• candidosi (forma latente);
• infezione da enterovirus;
• mononucleosi;
• listeriosi;
• salmonellosi (definizione di un ceppo specifico);
• virus del papilloma;
• garnerellosi;
• virus dell'encefalite da zecche.

Particolarmente popolare è l'analisi delle infezioni intracellulari (ad esempio la clamidia), la cui determinazione nel solito modo è difficile anche con un'alta concentrazione di questi microrganismi nei tessuti del paziente.

Data la multitasking della metodica, è possibile effettuare un'analisi PCR simultanea per 12 infezioni di base. Un approccio integrato è una scelta conveniente per lo screening di routine del corpo per le infezioni sessualmente trasmissibili con un rischio minimo di diagnosi errate.

Su una nota! Con l'aiuto della diagnostica PCR, viene fatta una previsione per le cosiddette forme di infezioni "dormienti" che si trovano nel corpo senza manifestare i sintomi della malattia (particolarmente importante nel trattamento di malattie ginecologiche e urologiche, tubercolosi, encefalite, papillomavirus).

Quali materiali biologici vengono studiati

Non ci sono regole o confini prestabiliti. La versatilità del metodo consente l'utilizzo di qualsiasi materiale biologico per le analisi:

• tampone vaginale, raschiatura dall'uretra e dal canale cervicale (per la diagnosi di malattie sessualmente trasmissibili);
• urina (tubercolosi, alcune malattie sessualmente trasmissibili, citomegalovirus);
• sangue (HIV, epatite, infezioni TORCH);
• tampone faringeo (mononucleosi, citomegalovirus);
• liquori (neuroinfezioni)
• liquido amniotico e tessuti placentari (analisi per infezione TORCH per prevenire patologie dello sviluppo fetale);
• liquido pleurico (infezioni polmonari).

Per altri tipi di diagnostica PCR (stabilimento di parentela, confronto di biomateriale), vengono utilizzati saliva, capelli, unghie, cellule epiteliali e altre fonti di informazioni genetiche.

Su una nota! Il metodo di diagnostica PCR rivela agenti patogeni non solo nella composizione dei tessuti viventi, ma anche in campioni di suolo, acqua, substrati vegetali; valutare l'attività patogena dei microrganismi sia nel corpo umano che nel suo ambiente (la presenza di una fonte accertata della malattia consentirà di adottare misure adeguate per prevenirla in futuro).

Come prepararsi per l'analisi

I pazienti della nostra clinica non hanno bisogno di chiedersi dove fare un test PCR. Forniamo tutte le condizioni per il campionamento sterile del materiale e l'invio al laboratorio.

Non è richiesta una formazione speciale, ma è consigliabile seguire un elenco di raccomandazioni generali. Rinunciare all'alcol per alcuni giorni, limitare il fumo, se possibile, escludere i farmaci, cercare di evitare situazioni stressanti e pesanti sforzi fisici.

Il resto della preparazione per il superamento dell'analisi dipende dal tipo di biomateriale:

• prima di fare uno striscio o raschiare per infezioni urogenitali, astenersi dai rapporti sessuali per 2-3 giorni (le donne dovrebbero assicurarsi che il giorno del test non cada nei giorni delle mestruazioni);
• prima di eseguire un esame del sangue per la PCR, astenersi dal mangiare al mattino (il test viene eseguito a stomaco vuoto) e bere un bicchiere di acqua pulita non gassata;
• prima di urinare, astenersi da cibi che influiscono sull'acidità delle urine (frutta, carne, legumi, verdure).

Importante! Il requisito più importante nella diagnostica PCR delle infezioni è la purezza del biomateriale. Pertanto, cercare di fare ogni sforzo per escludere la contaminazione dei tessuti con DNA estraneo (prendersi cura della sterilità del contenitore di spedizione, dell'igiene personale, dei vestiti puliti).

Decifrare l'analisi PCR

I risultati di un'analisi qualitativa della PCR per le infezioni sono riportati sotto forma di tabella, in cui ogni agente infettivo ha un segno corrispondente:

• risultato negativo (l'agente eziologico di questa specie è assente);
• risultato positivo (agente causale rilevato).

L'assenza di sintomi della malattia potrebbe non corrispondere al quadro reale, quindi per qualcuno i risultati dell'analisi saranno inaspettati. Non dovresti essere arrabbiato: identificare un agente infettivo nelle prime fasi è la chiave per una cura rapida e di successo.

Quando si esegue un'analisi PCR quantitativa, è possibile valutare il grado di carica virale (scoprire il numero di copie del virus per unità di volume). Grazie a questo tipo di studio, è possibile determinare l'intensità del decorso del processo infettivo, nonché valutare l'efficacia del trattamento.

Analisi PCR: prezzo e termini

Il tempo diagnostico medio è di 5-10 ore. I risultati sotto forma di tabella vengono emessi il giorno lavorativo successivo al campionamento del biomateriale.

Quando si sceglie un'analisi PCR, il prezzo non ha importanza. In media, l'importo dei costi non va oltre la portata dei test biochimici convenzionali e, a differenza della maggior parte degli studi genetici, è disponibile per tutti i pazienti.